María, reina de los escoceses ha abandonado su reino y está presa por su prima Isabel, reina de Inglaterra, en el castillo de Fotheringay. 
 
Acto I
 
Escena 1: Corte de la reina Isabel en Westminster
En el palacio de Westminster, los cortesanos atienden a la llegada de la reina Isabel pues el matrimonio debe reunir las coronas de Inglaterra y de Francia. En realidad, la reina, aunque consciente de las ventajas de esta unión para su país, es atraída por otro hombre distinto al rey de Francia y ella confiesa su duda dentro de una graciosa cavatina Ah, quando all'ara scorgemi.
Aprovechando la atmósfera que reina, Talbot le pide a la reina que perdone a la reina María Estuardo, pero su canciller, Lord Cecil, aconseja ejecutarla. Isabel pide al cielo que la guíe en sus actos y amenaza con vengarse de María Estuardo si se confirma que, como ella supone, Leicester está enamorado de ella, pues es el hombre del que la reina Isabel está enamorada.
Leicester entra e Isabel le nombra embajador ante el rey de Francia. Tras la partida de la reina y de los cortesanos, Talbot le dice que ha estado con María Estuardo en Fotheringay y que la reina presa ha pedido la ayuda de Leicester y le remite la carta que ella le dirige. Leicester se conmueve por el mensaje y la belleza del retrato que le presenta (Ah, rimiro il bel sembiante) y promete ayudar a la prisionera. Pero Isabel regresa, exige ver el billete que tiene en la mano y se da cuenta de que María no sólo ambiciona su trono, sino también al hombre que ella ama. Leicester niega estar enamorado de la reina de Escocia, no sin elogiar apasionadamente su belleza, y, aunque no sin reforzar sus sospechas, convence a Isabel para ir a visitar a su prima en Fotheringay (Era d'amor l'immagine y Sul crin la rivale).
 
Escena 2: Castillo de Fotheringhay (en muchas interpretaciones modernas esta escena es llamada Acto II, haciendo que el acto final se convierta en Acto III)
En el parque de Fotheringay, María, acompañada por su criada Anna, evoca recuerdos felices de la vida que pasó en la corte de Francia donde se crio (Oh, nube ! che lieve per l'aria ti aggiri). Luego llega el equipaje de Isabel, que caza en las cercanías de castillo. María, preocupada por la idea de encontrarse en presencia de su prima, se apresura a abandonar el lugar cuando llega Leicester, quien le aconseja someterse al mismo tiempo que promete vengarla si la reina se mantiene insensible a sus oraciones. Al final de su dúo, le pide a María que se case con él.
María se marcha y Leicester acoge a Isabel. Viendo María que Talbot está en su busca, ella rechaza hablar y murmura: E sempre la stessa, superba, orgogliosa ("Ella siempre es la misma, altiva, arrogante"). María se ve obligada a arrodillarse ante su prima y para implorar su perdón. Pero la reina la responde y, en un tono sarcástico, la acusa de haber traicionado y asesinado a su marido, Darnley, y luego culpa a Leicester quien intenta consolar a María. María responde con insultos a su prima, a la que trata de figlia impura di Bolena («hija impura de Ana Bolena») y de bastarda. La reina la condena a muerte y el acto culmina con un magnífico sexteto.
 
Acto II
 
Escena 1: Una habitación en los apartamentos de la reina Isabel
En el palacio de Westminster, Isabel aún no ha firmado la sentencia de muerte (Quella vita a me funesta) pero la vista de Leicester, a quien ella sospecha enamorado de su prima, y las presiones de Lord Cecil son la razón de su duda. Leicester pide misericordia, pero la Reina fríamente lo rechaza y le ordena que asista a la ejecución.
 
Escena 2: La habitación de María
En Fotheringay, María se confiesa con su fiel Talbot en una famosa escena. María cree ver el fantasma de su segundo marido, Darnley (al que el libretista llama Arrigo): Delle mie colpe lo squallido fantasma. Entonces recuerda dolorosamente a Rizzio (Quando di luce rosea) y niega cualquier participación en el asesinato de su marido, que ella atribuye a los celos de Isabel.
 
Escena 3: El patio en Fotheringhay
Los partidarios de María se indignan y Ana trata de calmarlos, acusándolos de perturbar las horas finales de su señora. Ruega a Dios de manera tranquila y patética (Deh! tu di un umile preghiera) mientras que se oye el primero de los tres disparos de cañón que anuncian la ejecución de la pena capital. Cecil viene a anunciar que Isabel le concede una última voluntad. María exige que Ana la acompañe justo hasta el pie del patíbulo (Di un cor che more). Leicester, molesto, aparece y el segundo cañonazo provoca su última protesta de inocencia (Ah, se un giorno da queste ritorte). Al tercer cañonazo, María camina, con la cabeza alta, hacia la muerte