ACTO I.- Plaza enfrente del palacio del Dux. En ella está situado el buzón donde se depositan las denuncias anónimas que se hacen al Tribunal de la Inquisición. Un grupo de alegres venecianas y venecianos cantan y bailan contemplados desde un rincón de la plaza por el espía Barnaba, al acecho siempre de que alguien cometa una falta para informar a los inquisidores. Este agente del Santo Tribunal ama a la cantante de coplas conocida en la ciudad con el nombre de la Gioconda. Ésta aparece conduciendo a su vieja madre ciega y Barnaba aprovecha la oportunidad para declararle la pasión que le inspira, mas la muchacha se aleja de él con repugnancia mientras busca al rico genovés Enzo, del que está enamorada. Llega a la plaza el gondolero Zuane, que acaba de ser vencido en unas regatas, y el pérfido espía, para vengarse de los desdenes de la Gioconda, le dice que la vieja ciega le ha echado un sortilegio que con su maléfico hechizo le ha impedido vencer. El gondolero, dominado por la cólera, intenta maltratar a la pobre anciana cuando aparece Enzo y lo impide.

Entran también el juez inquisidor Alvise y su bella esposa Laura, que sostiene secretamente relaciones amorosas con el noble genovés. Laura suplica a su marido que tome bajo su protección a la vieja mujer, la cual, conmovida por este generoso rasgo, hace entrega a la compasiva dama de su rosario, como prueba de gratitud. En tanto, el espía Barnaba ha observado las miradas apasionadas que Laura y Enzo se dirigían, y, para deshacerse de este rival en el amor de la Gioconda, trama una intriga a fin de perderle. Llevándoselo aparte, le dice que Laura le visitará aquella noche en la embarcación que tiene anclada en el muelle veneciano, a cuya noticia el joven aristócrata escapa para preparar un digno recibimiento a su amante. El vil espía informa después de lo mismo a Alvise, dándole cuenta de la hora y lugar exactos en donde podrá comprobar la infidelidad de su esposa. La Gioconda, que oye esta declaración, se ve asaltada por los celos al saber que Enzo ama a otra. Seguidamente aparece el coro de lindas muchachas y mozos venecianos, y bailan en medio de la plaza la famosa danza llamada " furlana".

ACTO II.- Puente de un navío amarrado en el puerto de Venecia. El espía Barnaba, disfrazado de pescador, canta en compañía de unos marineros. Después de mandar a uno de ellos a prevenir en su nombre a las galeras de la policía del Dux, se esconde. Llega Enzo a su buque y es saludado con aclamaciones por toda la tripulación. Él se siente feliz entre cielo y mar y cuando aparece su amada Laura la introduce a bordo diciendo que levarán anclas aquella madrugada para zarpar con las primeras luces de la aurora. Pero su dicha es turbada por la llegada de la celosa Gioconda, que disputa el cariño del hombre querido con la rival que se lo arrebata. Extrayendo una daga que llevaba escondida, se dispone a apuñalar a Laura, cuando percibe el rosario de su madre que aquélla lleva al pecho, y al recordar el generoso comportamiento con la pobre ciega, desecha su criminal propósito y se le ofrece como amiga. En aquel momento aborda el buque una de las naves de la policía conduciendo al marido de Laura, y la Gioconda, para salvarla del compromiso en que se encuentra si es sorprendida, la ayuda a escapar. Seguidamente informa a Enzo que los agentes del Dux vienen a prenderle, habiendo sido denunciado por el espía Barnaba. El joven genovés, prefiriendo perder su buque antes que entregarlo al innoble esbirro de los inquisidores, le prende fuego por su propia mano, poniéndose a salvo después.

ACTO III.- Salón en el palacio de Alvise. Este inflexible juez, aunque no ha podido comprobar plenamente la infidelidad de su esposo, decide que, para expiar sus aparentes ligerezas, perezca aquella misma noche. Así, pues, le ordena que beba un brebaje que contiene veneno y se libre ella misma de una vida que no ha sabido soportar con dignidad. La sumisa esposa promete obedecerle, mientras la Gioconda, que reconocida por el bien que hizo a su madre vela por ella, substituye el veneno de la copa por un fuerte narcótico. Laura lo ingiere y cae sumida en profundo letargo. Alvise, creyendo que ha muerto ya, abre las puertas del salón a sus invitados, a los que ofrece una gran fiesta en la que se ejecuta la deliciosa "Danza de las Horas". El implacable Barnaba dice a Enzo, que es uno de los convidados, que su amada ha muerto. En su desconsuelo éste trata de desenmascarar al anfitrión acusándole de celebrar un baile en su casa, donde hay una persona de cuerpo presente. Al escándalo que produce esta grave denuncia acuden los guardias, que arrestan a Alvise, el cual, antes de abandonar el salón, descorre una cortina y muestra el inanimado cuerpo de Laura, a la que dice ha dado muerte él mismo. Todos los comensales quedan petrificados de horror. Enzo trata de vengar a la que supone su difunta amada, asesinando al cruel marido, pero varios invitados lo detienen, y mientras los guardias se llevan a Alvise, él queda preso bajo la custodia de Barnaba. Entonces la Gioconda ofrece a éste acceder a su amor si pone en libertad a Enzo, trato que acepta el apasionado espía con la esperanza de poder poseer al fin a la mujer que ambiciona.

ACTO IV.- Ruinas de un castillo emplazado en la costa del mar Adriático. Hasta este apartado refugio ha conducido la abnegada Gioconda el aletargado cuerpo de Laura. Una vez ha llegado, dice a los hombres que la han ayudado a evadirse que vayan en busca de su anciana madre, pues teme que sus perseguidores se venguen en la infeliz ciega.

Aparece Enzo y Laura empieza a despertar de su pesado sueño. Los dos amantes se abrazan tiernamente y juran no separarse jamás. La desdichada Gioconda contempla este idilio con tristeza, pues piensa que está condenada a una eterna soledad, y después de ayudar generosamente a los dos amantes a ponerse a salvo, decide morir.

Cuando se dispone a engullir una pócima venenosa, aparece el espía Barnaba que viene a reclamar la promesa que le hizo. Ella finge estar dispuesta a cumplir la palabra empeñada, puesto que él cumplió con la suya, mas aprovechando una distracción del espía, saca su daga y se apuñala el pecho. El cruel Barnaba, viéndola moribunda, aún tiene tiempo de amargar sus últimos instantes de vida, diciéndole pérfidamente que antes de venir en su busca había dado muerte a su vieja madre.