Primer Acto
Cuadro Primero: Prisión en las cercanías de Sevilla
Jaquino, ayudante del carcelero Rocco, corteja a su hija Marcelina pero ésta lo desdeña porque a su vez ama a Fidelio. La joven no ha reconocido que el objeto de su amor es en realidad una mujer disfrazada de hombre.
Leonora, esposa de un noble que se encuentra prisionero en aquella fortaleza y a quien desea salvar, se ha introducido en la cárcel con ese propósito. Florestán ha despertado el odio y la persecución de Pizarro, gobernador de la prisión, por haber revelado al rey sus graves delitos. Para castigarlo, Pizarro lo ha recluido en una de las más horribles mazmorras de la cárcel, confiando su cuidado a Rocco, quien ignora la identidad del prisionero. Leonora ha tratado de granjearse la simpatía y la confianza de Rocco, ofreciéndose para secundarlo en sus tareas habituales. La sinceridad y el entusiasmo del supuesto joven se imponen rápidamente, y así Leonora llega pronto a colaborar con el carcelero en distintas ocupaciones.
Cuadro Segundo: Patio de la prisión
Alarmado por una denuncia sobre la situación de Florestán, Pizarro decide adelantarse y ordena a Rocco que por mandato superior dé muerte de inmediato al misterioso prisionero. El carcelero siente repugnancia por tan horrendo crimen y se resiste a obedecer. Pizarro, tentándolo con dinero, le ordena que abra una cisterna en los subterráneos de la cárcel para sepultar al recluso, que él personalmente habrá de sacrificar.
Leonora trata de acompañar a Rocco en tan ingrata tarea con la esperanza de hallar a su esposo y obtiene el consentimiento del carcelero para que los prisioneros salgan un momento al patio. Rocco, luego de una nueva entrevista con Pizarro, informa a Leonora que podrá acompañarlo. Leonora sospecha que esa tumba está destinada a Florestán.
Su emoción y su dolor casi llegan a traicionarla, pues Rocco, advirtiendo su estado de ánimo, le dice que él solo emprenderá la dura tarea. Ante la firmeza y decisión de su ayudante, Rocco concluye por acceder a sus ruegos. Enterado el gobernador de la liberalidad del carcelero, se presenta indignado y ordena que los reclusos sean encerrados nuevamente en sus celdas.
Segundo acto
Cuadro Primero: Calabozo de Florestán
Vencido por el hambre y los padecimientos, en alucinada exaltación, Florestán evoca a su esposa, a quien está seguro de no volver a ver.
Rocco y Leonora llegan para cumplir el mandato de Pizarro. El ruido despierta a Florestán. En la penumbra del calabozo, Leonora ha logrado descubrir a su marido, pero venciendo la emoción inicia su labor, secundando a Rocco. Pronto llega Pizarro, dispuesto a satisfacer su venganza, y se da a conocer. Pero cuando el gobernador, puñal en mano, intenta abalanzarse sobre Florestán, Leonora se interpone, haciendo escudo a su marido. Cuando Leonora revela su identidad, Pizarro intenta atacar nuevamente, pero ella lo amenaza con una pistola. En ese instante un toque de clarín anuncia la llegada del Ministro, enviado del rey. Pizarro, comprendiendo que es demasiado tarde para su venganza, sale acompañado por Rocco, dispuesto a recibirlo.
Los esposos, en apasionado reencuentro, abandonan el sombrío calabozo y ascienden hacia la liberación.
Cuadro Segundo: Acceso a la fortaleza
El Ministro Don Fernando llega para administrar justicia y liberar a quienes han sido injustamente encarcelados. Enterado de las crueldades que se han cometido en esa prisión -delitos certificados ahora por Rocco- el emisario real entrega a Pizarro a un tribunal para ser juzgado. Gracias al coraje y a la abnegación de su esposa Leonora, Florestán queda libre.