Acto primero
Cuadro Primero: Claustro en el Monasterio de San Justo
En la soledad del claustro los monjes elevan una plegaria implorando perdón para el alma del Emperador Carlos V. El infante Don Carlos viene en busca del sosiego en vano anhelado por su corazón. El joven ama a Isabel de Valois, princesa que le fuera prometida hasta que su padre, Felipe II, al morir su esposa María Tudor, contrajera matrimonio con ella, sellando así la esperada paz entre España y Francia.
Luego de evocar el recuerdo de la amada, Don Carlos cree reconocer en la voz de un monje, la voz del Emperador, confirmándose con ello la leyenda popular de que Carlos V erra por los claustros del convento. Don Rodrigo, marqués de Posa, amigo y confidente del príncipe, enterado de las inquietudes amorosas que desgarran su corazón, le propone que se dirija a Flandes para luchar allí por la causa del pueblo oprimido y olvidar sus penas de amor. Don Carlos acepta el consejo y ambos se prometen eterna lealtad. Poco después pasan Felipe II y su joven esposa. Don Carlos trata de ocultar la emoción que le produce la presencia de la reina. Mientras voces internas imploran desde la capilla, Don Carlos y Rodrigo, juran vivir y morir juntos por un idéntico ideal de libertad.
Cuadro Segundo: Exterior del Monasterio de San Justo
Las damas de la corte discurren amablemente. Para distraerlas la Princesa Eboli entona la canción del velo, una leyenda de amor oriental. La reina se reúne luego con sus damas. Llega el marqués de Posa, quien le hace entrega de una carta de Catalina de Medicis, madre de la soberana. Al mismo tiempo le desliza a escondidas una carta de Don Carlos. La reina agradece al Marqués su gentileza, circunstancia que el noble aprovecha para interceder en favor del infante.
La reina acepta una cita con el príncipe. Don Carlos suplica a su madrastra que intervenga para que su padre le permita marchar a Flandes. El infante, en un arranque de pasión, confiesa su terrible sufrimiento, lo amargo de su desventura, llegando a estrechar entre sus brazos a la soberana. Aunque ésta ama al infante apartándose de él, lo increpa severamente. Ante esta reacción Don Carlos huye desesperado.
Felipe II se presenta de improviso y al encontrar sola a su esposa, dispone imperiosamente el alejamiento de la Condesa de Aremberg, la dama de honor que debía acompañar en esos momentos a la reina. Isabel, luego de confortar con tiernas palabras a la desdichada dama, se aleja con su séquito. Al quedar solos el rey y Don Rodrigo, este último refiere al monarca las vicisitudes que afligen al pueblo flamenco, pidiéndole libertad de pensamiento y condenando la paz de los sepulcros que la dominación expande por doquier. A pesar de las palabras suplicantes de Rodrigo, el rey agrega que nadie como él conoce el corazón humano. Además hay que cuidarse del Gran Inquisidor... El soberano concluye confiando a Rodrigo la peligrosa misión de indagar cuál es la pena que aflige al infante y la extraña inquietud que ha notado en la reina.

Acto segundo
Cuadro Primero: Jardines Reales en Madrid
En el transcurso de una fiesta, la reina afligida se retira y para que su ausencia pase inadvertida cambia máscara y manto con la Princesa Eboli. Poco después llega Don Carlos, quien ha recibido un mensaje secreto citándolo en el jardín. Espera ansioso y al presentarse una dama velada, cree que es Isabel y le habla apasionadamente de su amor. Pronto el infante reconoce su error, rechazando desdeñosamente a la Princesa Eboli, la que instantáneamente descubre la pasión y el malentendido que ha inducido al Príncipe a acudir a la cita. Rodrigo, que vigilaba oculto, al oír las amenazas de Eboli, la increpa tratando de atacarla con un puñal. Don Carlos, le pide la entrega de cualquier documento importante o secreto sobre los asuntos de Flandes, ya que nadie en esos momentos se atrevería a dudar de él, amigo y confidente del Rey.
Cuadro Segundo: Plaza de Nuestra Señora de Atocha en Madrid
El pueblo y un grupo de monjes entonan un cántico, mezcla de alegría y oprobio. Felipe II, seguido por dignatarios y eclesiásticos, viene a presenciar el "auto de fe". A sus pies se inclinan los diputados flamencos implorando por la salvación de su patria. Ante la sorpresa del soberano, Don Carlos afirma que él mismo los ha guiado hasta su presencia.
Para el monarca español este pacto de rebeldía debe castigarse severamente. Frente al despotismo de su padre, el infante intercede en favor de los peticionantes. El rey, indignado por la osadía del príncipe, ordena que éste sea desarmado. Nadie se atreve a cumplir la orden real; sólo el Marqués de Posa, resueltamente, exige al infante la entrega de su espada. Arrestado Don Carlos, la regia comitiva se apresta a presenciar el "auto de fe".. Una voz celestial consuela las almas de los herejes en la hora extrema.

Acto tercero
Cuadro Primero: Gabinete del rey en Madrid
Felipe II, absorto en profundas cavilaciones, lamenta que la reina jamás lo haya amado, comprendiendo que ha vivido una quimera desde el momento en que Isabel llegara de Francia.
El rey se ha propuesto condenar a Don Carlos por haber levantado la espada contra él. Se presenta el Gran Inquisidor. Felipe le relata el acto de insubordinación cometido por su hijo.
El Inquisidor, agrega poco después que hay en la corte otro personaje mucho más peligroso que el infante: ese hombre es Rodrigo. El monarca no da crédito a la denuncia del Gran Inquisidor. Al salir éste, llega Isabel a quien acaban de robarle un cofre donde guardaba sus joyas. Felipe le dice que él mismo ha tomado el alhajero para examinarlo y exige a la reina que lo abra en su presencia. Isabel rehúsa y al hacerlo el rey por su propia mano, encuentra entre las joyas una miniatura con la efigie de Don Carlos. La reina protesta indignada contra la falsa sospecha y cae desvanecida al ser acusada de faltar a sus deberes de esposa.
Al llamado del rey acuden la princesa Eboli y Rodrigo. Tras unos instantes de vacilación Felipe abandona el gabinete. La princesa, abrumada por los remordimientos, confiesa a la reina que ella ha robado el cofre, agregando además que ha sido la confidente y la amante del rey. Isabel le exige la devolución de la cruz, atributo de su condición de dama de honor, y le impone abandonar la corte para terminar sus días en el exilio o en un convento. Eboli maldice su belleza, causa de tanto infortunio. En su desesperación invoca a la reina, a quien ha sacrificado por su deslealtad, y pensando también en el destino que aguarda al infante, confía aún en poder salvarlo.
Cuadro Segundo: Una prisión
Don Carlos se encuentra prisionero por orden de su padre quien lo ha entregado a la Inquisición. Rodrigo viene a explicarle que expone su vida por salvarlo. El rey lo considera ahora culpable, él es el agitador de Flandes. Carlos quedará libre y él podrá morir. Apenas ha pronunciado estas palabras suena un disparo; el noble cae mortalmente herido en brazos del infante. Sus últimas palabras son una ardiente súplica por la salvación de Flandes.
Felipe llega para reconciliarse con su hijo a quien desea devolver la espada. Don Carlos no quiere aceptarla y le descubre que Rodrigo se ha sacrificado por él. El pueblo, que se ha rebelado contra el rey, resuelto a liberar a su príncipe, intenta imponer su arrolladora fuerza. La llegada del Gran Inquisidor salva al rey de la ira del pueblo. Ante su suprema autoridad, los rebeldes se prosternan delante del soberano, implorando piedad.

Acto cuarto
En el monasterio de San Justo
Isabel evoca el recuerdo del Emperador Carlos V. Don Carlos se presenta y con tiernas frases que son a la vez, un himno de esperanza, se despide de su amada antes de partir secretamente para Flandes en cumplimiento de sus ideales de libertad. Esta escena es sorprendida por el rey y el Gran Inquisidor. Este último ordena a los guardias la detención del infante. Don Carlos se defiende, mientras la lucha queda interrumpida por la aparición del misterioso monje. Felipe II reconoce a su padre, el Emperador Carlos V, quien protegiendo a Don Carlos lo sustrae a la intervención de todo poder humano.