La ópera ocurre en Ninfea, puerto de Crimea, reino del Ponto en el año 63 a. C. El protagonista es el rey Mitrídates VI Eupator (132-63 a. C.). Enfrascado en sus luchas contra los romanos, deja a su prometida Aspasia, al cuidado de sus hijos, Farnaces y Sifares. Después de sufrir una severa derrota, Mitrídates es dado por muerto
Acto I
Escena 1
Arbate, el gobernador de Ninfea, da la bienvenida a Sifares que está enojado con su hermano, Farnaces, debido a los fuertes lazos que lo unen a los romanos, sus enemigos. Arbate jura lealtad a Sifares. Aspasia ruega a Sifares, para que la ayude a resistir los avances de Farnaces. Sifares acepta sus súplicas, y al tiempo revela su amor por ella. Aspasia ama secretamente a Sifares.
Escena 2
Farnaces, el primogénito, ofrece su amor a Aspasia, quien lo rechaza con el apoyo de Sifares, que la protege frente a su poderoso hermano. Llegan noticias de que Mitrídates está vivo y se acerca a la ciudad. Arbate insta a los hermanos a sobreponerse a sus diferencias y saludar a su padre. Farnaces conspira con Marzio, tribuno romano, contra Mitrídates.
Escena 3
Mitrídates llega a Ninfea con la princesa Ismene, hija del rey de los partos, para ofrecerla como esposa a su hijo Farnaces. Mitrídates quiere que Farnaces se case con Ismene, su prometida. Ismene está enamorada de Farnaces. Arbate le dice a Mitrídates que Farnaces persigue a Aspasia, pero no menciona a Sifares. Celoso, Mitrídates jura vengarse de Farnaces.
Acto II
Escena 1
Farnaces desprecia y amenaza a Ismene, y ésta se lo dice a Mitrídates, quien sugiere que se case con Sifares. Mitrídates pide a Aspasia que se casen inmediatamente, pero ella vacila, lo que demuestra su infidelidad. Aspasia le confiesa su amor a Sifares, pero acuerdan separarse para salvaguardar el honor. Sifares planea marcharse y Aspasia queda preocupada, inmersa en su conflicto entre el amor y el deber.
Escena 2
Mitrídates es consciente del complot de Farnaces y los romanos contra él, y planea vengarse, a pesar de la oferta de paz que Marzio le hace llegar. Detiene a Farnaces, acusado de traición. Ismene salva al príncipe Farnaces lo confiesa todo a su padre y es ingresado en prisión. Aspasia y Sifares declaran su amor y están dispuestos a morir, por temor a Mitrídates.
Acto III
Escena 1
Ismene, todavía enamorada de Farnaces, trata de convencer a Mitrídates para que perdone a Aspasia y Sifares. Los romanos, guiados por Marzio, atacan y Mitrídates se prepara para la batalla. Aspasia piensa en suicidarse ingiriendo veneno, y sólo la intervención de Sifares consigue salvarla. Sifares también quiere morir y une a su padre en la batalla.
Escena 2
Marzio libera a Farnaces y le promete el trono de su padre si le ayuda. Pero el príncipe cambia de idea, se arrepiente de su traición y se une al ejército de su padre.
Escena 3
Mitrídates es herido en combate y él mismo se arroja sobre su espada para suicidarse, ante la derrota. Antes de morir, perdona a sus hijos y da su bendición a Sifares y Aspasia, mientras Farnaces se declara dispuesto a desposar a Ismene. En el quinteto final Sifares, Aspasia, Farnaces, Ismene y Arbate declaran su intención de vengarse de los romanos y combatir a aquellos que pretenden acabar con la libertad del mundo entero.