Acto I - Iglesia Sant'Andrea della Valle

Angelotti, ex cónsul de la República de Roma, huye de la prisión y se refugia en la iglesia Sant'Andrea della Valle, donde se encuentra el panteón familiar. De acuerdo a un mensaje que le enviara su hermana, la marquesa Attavanti, allí encontraría ropas para disfrazarse y huir de Roma. Angelotti entra a la capilla y se esconde en ella. Aparece el Sacristán creyendo que alguien ha entrado pero solamente encuentra un cesto con comida del pintor Mario Cavaradossi.
Aparece el pintor para continuar con su trabajo, un cuadro con la imagen de María Magdalena en el que el Sacristán reconoce a una dama que había visto rezando en la iglesia. Sin embargo, el pintor solo piensa en Floria Tosca, su amada, actriz y cantante.
Angelotti, abandona su escondite creyéndose solo, y se encuentra con Cavaradossi quien está decidido a ayudarle a escapar. Se escucha la voz de Tosca que se acerca, y el pintor le ofrece comida a su amigo, quien se esconde nuevamente. Al llegar Tosca, está convencida de haber escuchado voces y le monta a su amante una escena de celos, que se agrava al notar el parecido de la Magdalena del cuadro con la marquesa Attavanti. Finalmente, acepta las explicaciones de Cavaradossi y se marcha.
Aparece nuevamente Angelotti y Cavaradossi le ofrece como refugio su casa de campo hasta abandonar el país. El ruido de un cañón proveniente del castillo de Sant'Angelo da cuenta de que se ha descubierto la fuga de Angelotti, y Cavaradossi decide acompañar personalmente a Angelotti a su casa.
El Sacristán entra jubiloso para comunicarle a Cavaradossi la noticia de que Napoleón Bonaparte había sido derrotado. Pero su alegría se interrumpe al llegar Scarpia, el jefe de policía de Roma, para registrar la capilla de los Attavanti, y encuentran un abanico con el escudo de armas de la familia Attavanti. Scarpia concluye que Angelotti ha sido ayudado a fugarse.
Reaparece Tosca buscando a Cavaradossi, y Scarpia sugiere que su amante se ha ido con la dama del cuadro. En un nuevo arranque de celos, Tosca decide ir a la casa de campo a sorprenderlos. Scarpia ordena a Spoletta que la siga y busque allá a Angelotti. Sin embargo, Scarpia confiesa que su intención no es solamente capturar al fugitivo sino también seducir a Tosca. Comienza el Te Deum y todos se unen en la plegaria de acción de gracias.

Acto II - Palacio Farnese. Oficinas de Scarpia

Desde su oficina en el Palacio Farnese, Scarpia medita sobre sus deseos amorosos y la búsqueda de Angelotti. Se escuchan los ecos de la fiesta en honor a la derrota de Napoleón, y Scarpia da la orden que Tosca sea conducida ante él una vez que finalice su actuación. Spoletta, presa del miedo, le informa que no pudieron hallar a Angelotti, pero que detuvieron a Cavaradossi.
Scarpia interroga a Cavaradossi, pero al no obtener resultados ordena que sea torturado hasta que confiese. En medio de la tortura llega Tosca, y horrorizada ante los gritos de su amante confiesa el lugar donde se oculta Angelotti.
Cavaradossi, iracundo acusa a Tosca de traidora, pero llega Sciarrone para informar a Scarpia que Napoleón había triunfado sobre el ejército austriaco en la batalla de Marengo. Cavaradossi exclama con júbilo su esperanza en el fin de la tiranía, y Scarpia responde ordenando que el prisionero sea ejecutado.
Tosca y Scarpia quedan solos, y el jefe de policía le ofrece salvar la vida de Cavaradossi si ella se entrega a sus deseos amorosos. Tosca no sabe como huir de esa situación, y a pesar de sus ruegos y lágrimas se ve obligada finalmente a ceder (Vissi d'arte), no sin antes exigir un salvoconducto para que ambos amantes puedan huir de la ciudad. Scarpia acepta y simula dar órdenes a Spoletta para simular la ejecución de Cavaradossi, y de esa forma mantener las apariencias y evitar sospechas respecto del acuerdo con Tosca.
Spoletta comprende las órdenes de Scarpia y se retira. Impaciente, Scarpia se acerca a su víctima, y Tosca, que toma un cuchillo de la mesa, lo apuñala en el pecho, toma el salvoconducto y escapa, luego de acercar dos candelabros junto al cuerpo de su enemigo y colocar en su pecho un crucifijo.

Acto III - Terraza superior del castillo de Sant'Angelo

Mientras amanece se escuchan las campanadas de las iglesias de Roma y el canto de Un pastor. Un Soldado trae a Cavaradossi, y el carcelero mira los papeles buscando el nombre del reo y le anuncia que solo le queda una hora de vida. A cambio de un anillo obtiene permiso de escribir unas líneas a su amada. Entra Tosca y se precipita hacia Cavaradossi, le muestra el salvoconducto y le relata lo sucedido. Le pide que actúe con naturalidad cuando simulen la ejecución. El pelotón se alista para el fusilamiento, dispara contra el reo, y Cavaradossi cae. Al retirarse los soldados, Tosca se acerca a su amante y lo llama para que escapen, pero Cavaradossi está muerto.
Comienzan a escucharse voces que se acercan en búsqueda de Tosca ya que ha sido encontrado el cuerpo de Scarpia, y Spoletta aparece junto a Sciarrone para detener a Tosca. Tosca, desesperada, sube rápidamente a la muralla del castillo, y se lanza al vacío